Witherspoon sinh ra tại New Orleans, Louisiana, trong một gia đình trung lưu. Cha cô, ông John Witherspoon, là một bác sĩ người Georgia. Mẹ cô, bà Betty, đến từ Harriman, tiểu bang Tennessee, là tiến sĩ ngành y tá và nay đang giảng dạy tại Đại học Vanderbilt. Witherspoon thuộc dòng dõi của John Witherspoon, hiệu trưởng thứ sáu của đại học Princeton và là một trong những người đã ký bản tuyên ngôn độc lập Mỹ. Bố của Witherspoon từng phục vụ cho một căn cứ quân sự tại Wiesbaden, Đức nên cô đã sống ở đó 4 năm thời thơ ấu. Khi trở về Mỹ, gia đình cô định cư tại Nashville, Tennessee.

Witherspoon được chọn làm diễn viên cho một chương trình quảng cáo năm 7 tuổi, đây được coi là động lực để cô bắt đầu các buổi học diễn xuất. Năm 11 tuổi, cô đứng đầu trong cuộc thi Ten-State Talent Fair. Witherspoon luôn có kết quả cao trong thời gian đi học và tự nhận xét mình là "một kẻ khác người và đọc rất nhiều sách". Khi nhắc đến lòng yêu sách của mình, cô đã nói "Tôi có thể nổi điên trong một hiệu sách. Nó khiến tim tôi đập nhanh bởi vì tôi muốn mua tất cả mọi thứ". Witherspoon tốt nghiệp trường trung học nữ Harpeth Hall School tại Nashville, và đã từng tham gia đội cổ vũ của trường. Cô đỗ vào Đại học Stanford, khoa Văn học Anh. Nhưng sau một năm học, cô rời trường để theo đuổi sự nghiệp điện ảnh.